Ligase

Ligase – Funktion

Ligasen sind Enzyme, die Verknüpfungen von Kohlenstoff mit Kohlenstoffen, Stickstoffen,

Sauerstoffen oder Schwefel katalysieren.

Ligasen sind ebenfalls in der Lage, Schwefel mit Metallatomen oder Zucker mit Phosphatresten zu verbinden. Die dabei entstehende Bindung ist eine kovalente Bindung.

Ligasen verbrauchen Energie, um eine solche Verbindung katalysieren zu können. Hierbei wird häufig die als Energiequelle das Nukleosidtriphosphat ATP, der universelle Energieträger der Zelle, genutzt. Nukleosidtriphosphate (NTPs) bestehen aus einer Base (in diesem Fall Adenosin), einem Zucker und drei Phosphatresten. Durch Abspaltung von einem Phosphatrest wird ATP zu ADP (Adenosindiphosphat) hydrolysiert. Dadurch wird Energie erzeugt, die in Organismen vielfältig genutzt werden kann.

In diesem Fall geschieht das, um die Katalyse durch die Ligase anzutreiben. In anderen Fällen werden auch gleich zwei Phosphatreste vom ATP abgespalten, woraufhin AMP (Adenosinmonophosphat) entsteht.

Diese Gleichung zeigt das typische Reaktionsschema von Ligasen, die bei der Verbindung von zwei Molekülen X₁ und X₂ ein Phosphatrest eines ATPs abspalten:

Ligasen können die Energie aus der Spaltung von NTPs direkt oder indirekt nutzen.

Ligasen werden einerseits von der Spaltungsenergie angetrieben, um die Energie direkt nutzen zu können. Andererseits nutzen Ligasen Moleküle wie NAD+ als Energiequelle. Diese wiederum müssen mithilfe von NTPs regeneriert werden, um erneut als Energiequellen dienen zu können. Auf diese Weise erhalten Ligasen zwar nicht direkt Energie von den NTPs, werden aber dennoch indirekt von ihnen angetrieben.

DNA-Ligasen

Eine spezielle Form der Ligasen sind die DNA-Ligasen.

Eine solche Bindung ist im Rückgrat der DNA zu finden, wo einzelne Nukleotide mit dieser Bindung zusammengehalten werden.

DNA-Ligase Funktion

Ligasen werden immer dann gebraucht, wenn bereits synthetisierte DNA Abschnitte miteinander verknüpft und die Lücken zwischen ihnen geschlossen werden müssen. Sie werden deshalb auch als "genetischer Klebstoff" bezeichnet.

Die Verbindung der Nukleotide ist deshalb nötig, weil die DNA Gefahr läuft, zu zerbrechen, wenn das Rückgrat nicht vollständig ausgebildet ist.

Dieser Fall tritt zum Beispiel dann ein, wenn bei der DNA Replikation der Folgestrang gebildet wird. Da die DNA von der DNA Polymerase in 5'–3' Richtung synthetisiert wird, müssen auf diesem Strang zunächst kleine DNA-Fragmente gebildet werden (Okazaki-Fragmente), bevor sie zu einem kontinuierlichen Strang zusammengefügt werden. Diese Aufgabe übernehmen die DNA-Ligasen. Sie können Reaktionen katalysieren, welche die Fragmente verknüpfen und die Lücken zwischen ihnen somit schließen.

Ein anderer Fall für DNA-Ligasen ist die Reparatur von anderweitig entstehenden Brüchen in der DNA. Wenn die DNA falsch synthetisiert oder durch äußere Einflüsse verändert wird, greifen Notfallmechanismen der Zelle, die diese Schäden reparieren. Für eine solche DNA Reparatur müssen die betroffenen Stellen zunächst herausgeschnitten werden, wenn die DNA nicht schon gebrochen ist. Um die gebrochenen Stränge wieder zusammenzufügen, lagern sich DNA-Ligasen an und schließen die Lücke, indem sie eine Phosphodiesterbindung bilden. Auf diese Weise tragen Ligasen dazu bei, das Erbgut der Zelle möglichst schadenfrei zu erhalten.

Arten von DNA-Ligasen – Beispiele

Je nach Organismus kann sich die Art der DNA-Ligase und auch ihre Funktion unterscheiden. Oft unterscheiden sich die Fähigkeiten der Ligasen darin, dass die Enden der gebrochenen und zusammenzufügenden Stränge entweder blunt oder sticky ends sind. Während bei blunt ends die DNA oder RNA so gebrochen ist, dass die Stränge auf beiden Seiten gleich lang sind, gibt es bei den sogenannten sticky ends Überhänge. In diesem Fall ist bei den beiden Seiten des gebrochenen Doppelstrangs immer jeweils einer der Stränge um einige Basen länger als der komplementäre Strang.

Zusätzlich unterscheiden sich manche DNA-Ligasen in der Art der Nukleinsäuren, die sie wieder zusammenfügen. So kann der Strang einsträngig oder doppelsträngig sein, aus RNA oder DNA bestehen oder sogar ein Hybrid aus beidem sein.

DNA-Ligasen in Säugetieren

In Säugetieren kommen drei wichtige DNA-Ligasen vor:

• DNA-Ligase IDiese fügt – wie oben beschrieben – Okazaki-Fragmente bei der DNA-Replikation wieder zusammen.
• IIIDie DNA-Ligase III fügt DNA-Enden bei der Basenexzisionsreparatur oder bei der Rekombination wieder zusammen.
• IVDie DNA Ligase IV wird für Prozesse, wie die nicht-homologe Endverknüpfung oder die V(D)J-Rekombination, verwendet.

T4 DNA-Ligase

Die T4 DNA-Ligase stammt aus einem Virus namens Enterobakteriophage T4. Bakteriophagen sind Viren, die Bakterien befallen und infizieren, in diesem Fall E. coli Bakterien. Ein anderer Name dieses Virus lautet daher auch Escherichia-Virus T4.

T4 Ligasen werden vom Virus für ihre DNA Replikation, Transkription und Rekombination in der infizierten Bakterienzelle verwendet. Ihre Besonderheit ist, dass sie außer doppel- und einzelsträngiger DNA und RNA auch DNA-RNA-Hybride zusammenfügen kann. Zudem verbindet sie sowohl blunt ends als auch sticky ends miteinander. Diese Eigenschaften machen sie zu vielseitigen Kandidaten für Anwendungen der Gentechnik. Hier ist es von Vorteil, wenn das verwendete Enzym mit mehr als nur einer speziellen Form der Erbinformation arbeiten kann.

Taq-DNA-Ligase

Die Taq-DNA-Ligase kommt in der Natur in Bakterien der Art Thermus aquaticus vor. Diese können sie nutzen, um doppelsträngige DNA zu replizieren, rekombinieren und reparieren. Für das Zusammenfügen zweier Stränge benötigen diese Ligasen sticky ends und werden durch NAD+ und nicht direkt durch ATP mit Energie versorgt.

Das Besondere an Enzymen aus dieser Bakterienart ist, dass sie hohe Temperaturen widerstehen können und ihre Funktion dabei nicht verlieren. Da T. aquaticus in heißen Geysiren lebt, sind seine Enzyme den Umweltbedingungen entsprechend angepasst und thermostabil.

Diese Stabilität der Enzyme bei hohen Temperaturen kann gut für verschiedene Methoden der Gentechnik genutzt werden, in der oft unter solchen Bedingungen gearbeitet werden muss.

Verwechslungen mit Ligasen

Häufig kommen Verwechslung von Ligasen mit anderen Enzymen vor, die ähnliche Funktionen haben. Aufgrund von in missverständlichen Namensgebungen oder verwandten Reaktionen werden entsprechende Enzyme falsch klassifiziert.

E3 Ubiquitin Ligasen

E3 Ubiquitin Ligasen gehören zu einer Gruppe Enzyme, die Ubiquitinierungen von Proteinen vermitteln. Durch das Anhängen einer Ubiquitin-Gruppe kann ein Protein für eine Vielzahl von Zwecken markiert werden.

Daher hat sie eigentlich eher die Funktion einer Transferase und ist auch als solche klassifiziert. Trotzdem werden diese Enzyme in der Literatur meistens als E3 Ubiquitin Ligasen bezeichnet – vermutlich da einer der Schritte, die bei einem Transfer nötig sind, die Synthese einer neuen Bindung ist.

Synthase vs. Synthetase

Eine andere Rolle spielt ein veralteter Name für Ligasen: Synthetase. Synthetasen sind anfällig dafür, mit Synthasen verwechselt zu werden. Während Synthetasen – also Ligasen – für die Verknüpfung zweier Moleküle eine NTP-Quelle benötigen, ist das bei Synthasen nicht zwingend der Fall.

Synthase ist ein Überbegriff für Enzyme, die eine Synthese katalysieren, egal ob mit oder ohne NTP als Energiequelle. Synthetasen sind also zwar eine Untergruppe der Synthasen, aber nicht zwingend dasselbe.

Anwendungsgebiete von Ligasen

In der Gentechnik können Ligasen für eine Vielzahl von Methoden eingesetzt werden, in denen eine Ligation (Verknüpfung) notwendig ist.

Arbeit mit Restriktionsenzymen

Für einige Methoden der Gentechnik ist es nötig, einen Restriktionsverdau einzusetzen. Dabei werden Restriktionsenzyme genutzt, die durch eine Sequenzerkennungsstelle einen DNA-Strang an einem Punkt mit genau definierter Basensequenz aufschneiden können. Nach so einem Schnitt können – je nach verwendetem Restriktionsenzym – blunt oder sticky ends entstehen.

Ein Restriktionsverdau kann zum Beispiel für eine spätere Klonierung durchgeführt werden, bei der neue DNA-Abschnitte in den nun offenen Strang eingebaut werden sollen. Der hierbei entstehende DNA-Strang wird auch als Rekombinant oder als Hybrid-Plasmid bezeichnet.

Um die Lücken zwischen den zusammenzufügenden DNA-Abschnitten wieder zu schließen, können Ligasen eingesetzt werden. Die hierfür am häufigsten verwendeten Ligasen sind T4 DNA-Ligasen, da sie sehr zuverlässig sind, sowohl für das Zusammenfügen von blunt ends, als auch von sticky ends. Zwar können auch Taq-DNA-Ligasen oder Ligasen aus E. coli-Bakterien verwendet werden, das kommt allerdings nicht so häufig vor, da diese beiden Ligasen ungenauer sind und nur sticky ends verknüpfen können.

Haben die DNA-Abschnitte sticky ends, können die Ligasen unter bestimmten Bedingungen sogar DNA-Stränge aus verschiedenen Organismen miteinander verknüpfen (z. B. Maus mit Bakterie).

Ligase von Plasmiden

Mithilfe einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) kann DNA, die nur in kleinen Mengen vorliegt, vervielfältigt werden.

Dafür werden bei der PCR die Doppelstränge der DNA aufgetrennt und zu jedem Einzelstrang wird ein komplementärer Strang synthetisiert. Der neu entstandene Doppelstrang wird wieder getrennt und der Zyklus mehrere Male wiederholt.

Versucht man ringförmige Plasmid-DNA (aus Bakterien) per PCR zu vervielfältigen, tritt jedoch das Problem auf, dass die DNA-Stränge im Endprodukt linear sind (quasi wie ein Faden, statt einem geschlossenen Ring). Mithilfe von Ligasen können die Enden dieser linearen Stränge wieder zu einem Kreis zusammengefügt werden.

Da in einer PCR sehr hohe Temperaturen von bis zu 90 °C erreicht werden, bietet es sich hier an, Taq-DNA-Ligasen aus T. aquaticus zu verwenden. Sie halten die hohen Temperaturen aus und sind auch dann noch aktiv.